No category

منابع مقاله درباره بیمارستان

دانلود پایان نامه

شده از ناحیه ۵´UTR ژنوم این ویروس و تعیین ژنوتیپ آن بوسیله تعیین توالی نوکلئوتیدی ژن VP1جداکردند که از ۱۷ نمونه مثبت شده ۱۵ نمونه آن Hpev1 2نمونه Hpev3بوده (۱۲۱).
در مطالعاتی که در فنلاند انجام شد تاثیر Hpev1را بر روی سلول های که مورد بررسی قرار دادند و نشان دادند که تیپ یک با تخریب سلول های ? باعث بیماری دیا بت نیپ ۱ می شود (۱۲۳).

فصل سوم
مواذ و روشها

*مواد و روش ها:
تعداد ۲۵۰ نمونه مدفوع مربوط به کودکان زیر چهار سال با علائم اسهال، از بیمارستان تشخیصی طبی کودکان مورد بررسی قرار گرفت.
(۱-۳آماده سازی میکروتیوب و سرسمپلرها:
برای جلوگیری از آلودگی احتمالی میکروتیوب ها و سر سمپلرها با آنزیم RNase ، این وسایل قبلاً به مدت یک شبانه روز در
محلول ۱% (حجمی حجمی) (Drethyl pyrocarbonate) DEPC قرار گرفتند و سپس اتوکلاو شدند.
محلول DEPC ترکیبی است که ساختمان پروتئینی آنزیمهای RNase و ساختار اسیدهای نوکلئیک را تخریب میکند لذا پس
از مجاورت وسایل پلاستیکی با آن لازم است برای جلوگیری از اثرات مخرب آن بر RNA، وسایل اتوکلاو شوند تا DEPCغیر فعال گردد..
(۲-۳مواد لازم برای تهیه سوسپانسیون:
ابتدا محلول های زیر تهیه و به طور جداگانه به مدت ۲۰ دقیقه اتوکلاو شدند.
محلول A:
(PH=7.4) PBS شامل NaCl (g8)، KCl (g2/.) ، Na2HPO4 (g 91/.) و KH2PO4(g 12/.) درml1000
محلول B‌: MgCl2.6H2O (g/100ml1/.)
محلول C: CaCl2 (g/100ml1/.)
برای تهیه محلول کار مورد نیاز ۱ حجم از محلول B با ۱ حجم از محلول C‌و ۸ حجم از محلول A مخلوط گردید. برای تهیه
سوسپانسیون از نمونه های مدفوع ۴ml از محلول کار با ۱ml کلروفرم در لوله فالکون ۱۵ ml مقاوم به کلروفرم مخلوط و
حدود، ۲ گرم مدفوع با سواپ به آن افزوده شد. لوله ها به مدت ۲۰ دقیقه روی شیکر قرار گرفتند و سپس به مدت ۱۵ دقیقه
در ۴°C با دور g 1500 سانتریفوژ شدند. محلول روئی حاوی ویروس بوده و ۲۰۰ ml از آن برای استخراج RNA به سرعت
به میکروتیوب ۱/۵ ml منتقل شد و بقیه نیز در فریزر°C -20 نگهداری گردید.

*RT-PCR:
با توجه به اینکه پاراکوویروس تیپ یک انسانی RNA ویروس است. بنابراین از روش RT-PCR استفاده گردید و پس از
جداسازی RNA از آن بعنوان الگو برای ساخت cDNA استفاده شده و ، cDNA‌تهیه شده برای تکثیر به روش PCR‌ به
میکروتیوب دیگری منتقل گردید. جزئیات در زیر توضیح داده شده است.
(۳-۳ جداسازی RNA و ساخت cDNA:
برای جداسازی RNA از محلول( RNXشرکت سیناژن باcat:RN7713C) که حاوی( guanidine salt وphenol solu. )میباشد به شرح زیر طبق پروتوکل کیت مربوطه استفاده شد :
در یک میکروتیوب ۱/۵ ml که حاوی ۲۰۰ ?l از سوسپانسیون است ۸۰۰ ?l محلول RNX اضافه کرده و به مدت ۱۵-
۱۰ ثانیه با دست تکان میدهیم. سپس به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق قرار داده و پس از آن ۲۰۰ ?l کلروفرم به آن اضافه
کرده، ۳۰-۱۵ ثانیه به شدت آنرا تکان میدهیم و به مدت ۵ دقیقه در°C20- قرار داده، سپس در °C4 به مدت ۱۵ دقیقه با
دور ۱۲۰۰۰ g سانتریفوژ کردیم . بعد از سانتریفوژ محلول داخل میکروتیوب حاوی ۳ فازاست که فاز رویی فاز آبی بوده و
حاوی RNA است. فاز میانی بسیار نازک و حاوی قطعات تخریب شده ویروسی و فاز انتهایی که زرد رنگ است حاوی مخلوط
کلروفرم و محلول استخراج ویروس می باشد. فاز رویی را به آرامی به کمک سمپلر جدا میکنیم به نحوی که هیچ تداخلی با فاز
میانی پیدا نکند. حجم این بخش حدود ۸۰۰ ?l است و به یک میکروتیوب استریل جدید منتقل میشود و هم حجم آن
ایزوپروپانول به آن افزوده میشود. برای تشکیل رسوب به مدت ۲-۱ ساعت در فریزر ۲۰°C- قرار می دهیم و سپس آنرا در°C
۴ درجه به مدت ۱۵ دقیقه با دور ۱۲۰۰۰ g سانتریفوژ میکنیم . محلول روئی را خالی کرده و ۵۰۰ ?l اتانول ۷۰% اضافه
کرده و به مدت ۳ دقیقه با دور ۷۵۰۰ g در°C 4 سانتریفوژ می‌کنیم. در این مرحله رسوب RNA در ته میکروتیوب قابل
رویت است. الکل را خالی کرده و میکروتیوب را به صورت وارونه بر روی دستمال تمیز قرار میدهیم تا اتانول آن تبخیر شود
زیرا اتانول موجود در میکروتیوب در صورت عدم تبخیر موجب تداخل در مراحل PCR می شود. باید دقت کنیم که ضمن
خشک شدن الکل رسوب کاملا خشک نشود زیرا در میزان RNA آن نقصان ایجاد میشود. با توجه به اندازه رسوب موجود در
میکروتیوب ?l25- 12 DEPC treated water به آن اضافه کرده وبه مدت ۱۰- ۵ دقیقه در بن ماری °C60- 55 قرار
می دهیم ( حرارت به باز شدن ساختارهای ثانویه احتمالی در RNA کمک میکند) و بلافاصله به یخ منتقل می کنیم تا
بسرعت وارد مرحله ساخت cDNA بشود. نگهداری RNA برای مدت طولانی فقط در فریزر°C80- امکان پذیر است.
(۴-۳سنتز cDNA:
برای سنتز cDNA از کیت سنتز cDNA استفاده می کنیم. طبق پروتوکل کیت به میزان۱۰ng-5?g RNA نیازمندیم .میزان RNA استخراج شده را با کمک دستگاه نانودراپ بدست آوردیم و با توجه به دستور پروتوکل میزان ?l9 از RNA را برداشته و به آن oligo dT به میزان ۱?lاضافه کرده به مدت ۵ دقیقه در دمای ۶۵°C ‌قرار می دهیم سپس به میزان ۱۰?lاز محلولPrimix RT اضافه کرده ( حجم نهایی ۲۰?l) و طبق جدول زیر انکوبه میکنیم .
زمان
دما
۵ دقیقه
۶۰ دقیقه
۱۰ دقیقه
۲۵ درجه
۵۰ درجه
۷۰ درجه
cDNA تهیه شده به یخ منتقل شده و بلافاصله بعنوان الگو در واکنش PCR به کارگرفته میشود. و یا در۸۰ – نگهداری می شود.
روش تهیه کنترل مثبت(C+) برای PCR :
برای انجام PCR ما نیازمند به کنترل مثبت بودیم ولی چون نمونه پاراکوویروس را در اختیار نداشتیم , از پلاسمید PFG1 که حاوی کل ژنوم HPEV1 بود توسط خانم دکتر قاضی تهیه شده و استفاده نمودیم .
۳-۵) تهیه محیط کشت های مورد نیاز برای Compatent:
برای این مرحله به محیط کشت آگار و براث بدون آنتی بیوتیک برای کشت و تکثیر سلولها قبل از ترانسفورم و محیطهای
واجد آنتی بیوتیک برای کشت و رشد سلولهای ترانسفورم شده نیازمندیم . پلاسمید PFG1 دارای ژن مقاومت به آمپی سیلین
است لذا از این آنتی بیوتیک در محیط کشت استفاده شد.

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   منبع پایان نامه ارشد با موضوععلوم اجتماعی، الهیات مسیحی، پوزیتیویسم، استراتژی

جدول۴ -تهیه محیط کشت :
محیط کشت
آمپی سیلین
Yeast extract(g)
Nacl (g)
Trypton (g)
Agar(g)
LA (1000cc)

۵
۵
۱۰
۱۵
LA (1000cc)
میگروگرم برای
ml1000
۵
۵
۱۰
۱۵
LB(1000cc)

۵
۵
۱۰
—————–
LB(cc1000(
میگروگرم برای
ml1000
۵
۵
۱۰
——————
با آب مقطر به حجم مورد نظر رسانده و سپس اتوکلاو می کنیم.
– در زیر هود و کنار شعله، آنتی بیوتیک را به محیط کشت اضافه کرده و به پلیت ها منتقل میکنیم. وپس از خنک شدن پلیت ها را در یخچال نگهداری می کنیم.
پروتکل Compatent:
از محیط کشت سوش DH5? به کمک لوپ و در کنارشعله سلولها را به ml 10 از LB بدون آنتی بیوتیک که در فالکون
cc50 ریخته شده بود منتقل میکنیم و در داخل انکوباتور°C 37 و روی شیکر با سرعت RPM 250 به مدت یک شبانه
کشت میدهیم. صبح روز بعد µL500 از محیط را برداشته و به ML50 محیط LB بدون آنتی بیوتیک که در داخل ارلن است
منتقل کرده و به مدت ۲ ساعت در °C 37 و روی شیکر با سرعت RPM 250 کشت میدهیم. در این فاصله به منظور
نگهداری طولانی مدت سوش باکتری باقیمانده به روش زیر عمل میکنیم.
*روش نگهداری سوش(Stock ):
به منظور نگهداری طولانی مدت سوش باکتری، باقیمانده محیط کشت (ml 5/9) که در فالکون باقیمانده است، در ۴ درجه با
دورg 1600 به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ میکنیم, تا سلولها کاملا ته نشین شوند. سپس با سمپلر محیط کشت را کاملا از
روی سلولها خارج کرده و سپس حدود Lµ ۶۵ محیط تازه روی سلولها ریخته و Lµ ۳۵ گلیسرول (۱۰۰%( اتوکلاو شده به
آن افزوده به آرامی سلولها را مخلوط و با حجمهای مساوی به ده میکروتیوبml 5/1 اتوکلاو شده منتقل کرده، درب آنرا با
پارافیلم محکم بسته و در ۸۰- درجه نگهداری می کنیم.
– OD سلولهای محیط کشت درون ارلن که برای دو ساعت در انکوباتور شیک شده بود را برای اطمینان از رسیدن آنها به فاز
لگاریتمی رشد، بررسی کرده و پس از اطمینان از این موضوع محتوی ارلن را به فالکون ml50 منتقل کرده و به مدت ۱۵
دقیقه بطور کامل در یخ فرو میبریم و سپس در °C 4 با دورg 1600 به مدت ۷ دقیقه سانتریفیوژ میکنیم تا رسوب سلولها
بدست آید. محلول روئی را با سمپلر بطور کامل خالی میکنیم. ‍‍ml 10 cacl2 (100 میلی مولار استریل) به رسوب سلولها
اضافه کرده به آرامی پی پتور میکنیم و به مدت ۳۰ دقیقه بر روی یخ قرار میدهیم. سپس با دور g1100در °C 4 به مدت
۵ دقیقه سانتریفیوژ کرده , و درحالیکه فالکون روی یخ قرار دارد محلول روئی را با سمپلر خارج کرده ومجددا ml10 cacl2
(۱۰۰ میلی مولار استریل) به آن اضافه کرده و به مدت زمان ۳۰ دقیقه بر روی یخ قرار می دهیم . سپس با دور g 1100 در
°C 4 به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ کرده محلول روئی را کاملا خارج میکنیم.انتظار داریم که در این مرحله باکتریها
competent ant شده باشند.
Lµ ۱۶۰۰ از cacl2 (100 میلی مولار استریل)و µL400 گلیسرول (استریل ۱۰۰%) روی یخ به آن اضافه کرده و پی پتور
می کنیم.این µL100 سوسپاتسیون سلولی بطور مساوی به ده میکروتیوب ml 5/1 اتوکلاو شده منتقل شده ، درب آنرا با
پارافیلم محکم بسته و در ۸۰- درجه نگهداری می کنیم.
۳-۶) پروتوکل ترا نسفورم کردن:
دو محیط کشت آگار بدون AMP و ۴ محیط دارای AMP را از داخل یخچال به میز آزمایشگاه منتقل می کنیم تا به دمای
آزمایشگاه برسندو بن ماری را در ۴۵ درجه تنظیم کرده و سپس یک ویال حاویLµ ۱۵۰۰ محیط LB فاقد آنتی بیوتیک را
نیز به بن ماری ۴۵ درجه منتقل می کنیم.
جذب DNA پلاسمید درnm 260 (بلانک با آب مقطری که پلاسمید در آن حل شده است ) میخوانیم.
– سلول های مستعد (سلول های کامپیتنت DH5?) را از فریزر۸۰ – خارج کرده وبر روی یخ قرار داده تا ذوب گردد سپس
سلول ها (DH5?) را به آرامی مخلوط کرده وLµ ۱۰۰ از آن با Lµ ۵ از پلاسمید (۱۰۰-۱ نانوگرم پلاسمید برای ۵۰
میکرولیتر سلول) در داخل میکروتیوب ml 5/1 استریل که کاملا در یخ فروبرده شده بود مخلوط گردید. بقیه سلولها به
۸۰ – منتقل شده . ویالهای حاوی سلول و پلاسمید برای ۴۵ دقیقه روی یخ مانده و

دیدگاهتان را بنویسید