سپس برای ۴۵ ثانیه به بن ماری ۴۲
درجه منتقل میشود- بعد از این مدت بلافاصله به مدت ۵ دقیقه روی یخ می گذاریم (شوک حرارتی). در این مرحله انتظار
داریم که پلاسمید وارد برخی از سلولها شده و در مخلوط سلولهای ترانسفورم شده داشته باشیم – سپسml1 محیط LB که
در بن ماری تا ۴۲ درجه گرم کرده بودیم به آن منتقل می کنیم و سپس به مدت ۳۰ دقیقه در دمای محیط قرار می دهیم. –
L µ۲۰۰-۱۰۰ از ویال حاوی سلولهای ترانسفورم شده را بر روی پلیت آگار حاوی آنتی بیوتیک کشت می دهیم و سپس به
مدت ۱ شبانه روز درون انکوباتور می گذاریم. چنانچه سلولها ترانسفورم شده باشند روی محیط دارای آمپی سیلین رشد
خواهند کرد.
جدول۵- تهیه محلول های مورد نیاز برای استخراج پلاسمید به روش mini prep :
محلول S1 : (GTE)
گلوکز
۵۰ mM? 0.4505 g
Tris-cl
۲۵ mM ?0.151375 g
EDTA
۱۰ mM?0.18612 g
حجم نهایی ۵۰ CC
PH مورد نظر را اندازه گرفته , آن را روی ۸ تنظیم میکنیم.
محلول S2 :
NaoH ./2 N
./۴g
SDS ./.1
./.۱
حجم نهایی برای ۵۰ CC
*SDS نباید اتوکلاو شود زیرا رسوب می کند در نتیجه باید با آب مقطر استریل به حجم مورد نظر برسد
محلول S3 :
پتاسیم استات ۵m و۶۰ ml
۱۱.۰۲ g
Glacial acetic acid
۴.۳۴ ml
H2O
۲۲.۵ ml
Glacial acetic acid باید زیر هود ریخته شود.
محلول S4 : ایزوپروپانول سرد
محلول S5 : اتانول خالص
محلول TE :
Tris-cl (10 mM)
۰.۰۶۰۵۵g
EDTA (1mM)
۰.۰۱۸۶g
EDTA (1mM) , PH مورد نظر ۸ می باشد.
Mini prep protocol ( 7-3 (استخراج پلاسمید):
– یک کلنی از باکتری ترانسفورم شده را درml 2 محیط LB دارای آنتی بیوتیک داخل فالکون ml15 ریخته و برای یک
شبانه روز داخل انکوباتور قرار می دهیم. – محتوی فالکون را به یک میکروتیوبml 2 منتقل کرده و به مدت ۷ دقیقه با دور
g1600 سانتریفیوژ میکنیم. محیط روئی را با دقت خالی کرده lµ۲۵۰ از محلول GTE (محلول S1) را روی رسوب ریخته
و توسط سمپلر سوسپانسیون می کنیم .
lµ ۲۵۰ از محلول NaoH/SDS (محلول S2) را روی آن ریخته و با سروته کردن مخلوط می کنیم.محلول بتدریج شفاف تر
می شود و به محض شفاف شدن محلول ها به مرحله بعدی می رویم. lµ ۲۵۰ از محلول S 3 را به میکروتیوب انتقال داد
ه و آنرا ۱۵ ثانیه ورتکس می کنیم و سپس برای ۱۰ دقیقه با سرعتg12000 سانتریفیوژ می کنیم . در این مرحله , توده
سفید تخم مرغی رسوب میکند وما فاز شفاف روئی را که حاوی پلاسمید است و حجمی حدود lµ۶۰۰ دارد بر داشته به
میکروتیوب استریل منتقل میکنیم. هم حجم آن ایزوپروپانول خنک و خالص اضافه کرده و به خوبی آنرا مخلوط می کنیم و
سپس یکساعت در دمای ۲۰- درجه قرار می دهیم.
– میکروتیوب ها را به مدت ۱۰ دقیقه با سرعت بالا سانتریفیوژ کرده و محلول روئی را با دقت خالی می کنیم. ml1 اتانول
۷۰./. را به نحوی در میکروتیوب ریخته که رسوب ته آن کنده شود و در داخل اتانول شناور گردد. – ۳ دقیقه با سرعت بالا
سانتریفیوژ کرده و محلول روئی را با دقت خالی کرده و میکروتیوب را به صورت وارونه روی دستمال کاغذی قرار می دهیم تا
الکل آن کاملا تبخبر شود. – قبل از خشک شدن کامل رسوبlµ ۱۰۰ آب مقطر (Nuclease free water) روی آن
ریخته و فرصت می دهیم تا رسوب کاملا حل شودOD پلاسمید استخراج شده را اندازه گیری میکنیم.
PCR (8-3 شماره یک:
طراحی پرایمر برای ناحیه ۵’UTR ژنوم پاراکوویروس تیپ یک با استفاده ازتوالی ژنوم پاراکوویروس تیپ یک موجود در بانک ژنی. طبق جدول شماره ۴ انجام شد.
جدول ۶: توالی و موقعیت پرایمرهای طراحی شده برای ناحیه ۵’UTR ژنوم پاراکوویروس

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *